HCV感染的實驗診斷
    之前，小編已經為大家介紹過了HCV丙型肝炎的特點以及相關分析。那么目前，通過相關醫療器械檢查，能夠用于HCV感染的實驗診斷方法主要有兩種，檢測抗一HCV 和HCV RNA。
    1 抗一HCV檢測
    1989年5月，美國Chirob公司用分子克隆法分離到一個能表達NANB肝炎病毒特異性蛋白的cDNA克隆5-1—1。又將3個與5-1—1有共同ORF的重疊克隆連接起來建立了另一個克隆C100 。通過體外診斷試劑研究，C100與超氧化物歧化酶(SOD)基因融合在酵母中重組表達的多肽即C oo一。。完整的C·oo一。多肽的N端有154個SO D氨基酸，5個由EcoR I位點人工接頭表達的氨基酸和363個HCV C100。cDNA編碼的氨基酸；在其C端還有5個MS2的氨基酸。HCV C oo一?？贵w檢測系統，是最早應用的檢測方法。世界各地關于HCV在各種人群中的感染率，基本上都是來自這種試劑盒的檢測。檢測結果證明，HCV是世界上幾乎所有輸血后非甲非乙型肝炎和部分散發性非甲非乙型肝炎的病因病毒。由于Cloo只含363個氨基酸，而HCV基因組編碼的蛋白有長達3 010個氨基酸。因此C1oo一。抗原一抗體系統只代表整個HCV抗原抗體系統的-4'部分，所以敏感性不高，抗C100。一。出現也太晚，不適于早期診斷，且有些病人根本不出現。該方法使用的抗原含SOD融合蛋白，因此當人體存有抗一SOD時常常出現假陽性。但采用RIBA方法能排除因C 100。一?？乖泻琒OD部而引起的假陽性反應，常被用作確認實驗。第一代的RIBA-1試劑，含有C1oo一。、5-1—1兩種抗原(包括SOD序列)，同ELISA相比特異性明顯提高，避免了假陽性，但靈敏度都降低了。第二代RIBA-2試劑含有四種抗原。在C 100-3。、5-1-1基礎上又增加了兩個抗原。C(NSa區)和C2z一。(C區)使用多個抗原之后，不僅提高了檢測特異性，而且大大提高了靈敏度，對于ELISA方法檢出的可疑或弱陽性樣本，尤其適用RIBA方法做確認實驗。隨著HCV基因序列的闡明，人們發現C區基因編碼蛋白較E區和某些非結構區蛋白都保守。因此，用C區基因產物檢測HCV抗體顯得更加合理，于是相繼建立了一些新的檢測方法，試圖克服C100。抗原的某些缺陷，稱之為第二代抗一HCV試劑。第二代重組基因多肽檢測抗一HCV的ELISA技術是在原包被抗原加入了核心抗原C2z一。、C o、C o。和第一代試劑 (C100—3)相比，第二代試劑具有檢出率高(可提高25 ～30％)，而且抗體出現提早到16～60天。由于重組基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以仍存在抗一SO D造成的假陽性，于是人們開始采用人工合成肽段建立檢測抗一HCV的新試劑。用中國北方地區HCV全基因序列，根據文獻開發的預測蛋白理化性質及二級結構和抗原決定簇可能位點的序列軟件，完成了HCV全基因序列的親水性、親近性、移動性分析，已預測到HCV抗原決定簇的位點。先對研制的C區3個寡肽(CPA、C e、CPzo)進行了抗原活性比較并初步應用于臨床，同時與日本基因工程C區表達多肽C 進行比較。CP8+CP。e陽性率與C 的陽性率無明顯差異，符合率為87．6 。用所建立的雙PCR試驗，比較82例抗一CP與HCVRNA的檢測結果，符合率為87．5 。許多國家的經驗證明，對獻血員進行抗一HCV測定，可大大降低輸血后患丙肝的風險[20]，降低丙型肝炎的發病率 ]。因此HCV檢測可成為早期感染的檢測指標[7 ]。
2 HCVRNA的檢測
    聚合酶鏈反應是目前分子生物學中最敏感的方法，樣品中只要有一個拷貝的HCV 序列就有可能被檢出。由于HCV在被感染者體內濃度很低，逆轉錄RNA PCR(RTPCR)才能檢測到血清中的HCV RNA。PCR技術有許多優點：(1)特異性強?？挂籋CV陽性不能直接說明受檢者體內當時HCV是否存在，而PCR所檢的HCVRNA可作為有無傳染性的直接指標。(2)敏感性高?？砂l現抗一HCV陰性者HCV感染。(3)陽性出現早?？稍贏LT增高的同時檢出。黑猩猩感染HCV后第3天即可在血清中檢出HCV RNA。(4)應用較廣泛?？蓹z測組織和體液中RNA。但操作程序較復雜，技術要求嚴格，試驗成本高，所以只限于有條件的實驗室使用。1991年由北京醫科下學肝病研究所建立了一項直接檢測HCV PCR的雙重PCR法，亦可稱“一步法”。特點是微量(可從100~1血清中提到RNA)、簡便(不用低溫超速離心機等設備)、快速(從提取RNA逆轉錄可在4小時完成)、減少Rnase污染，1～2天內可發報告。由于PCR的諸多優點，只要不斷的改進方法，使之更趨簡便、快速，必將成為HCV感染診斷的重要手段。最近有研究結果表明，在原RT—PCT的基礎上再進行定量PCR，其方法是在樣品PCR反應混合液內加入。HdTTP摻入，液閃法測定。H摻入的CPM值以純化已知濃度的cDNAsfuw(
    10pg／每管30UI)，再計算待測血清中RNA的動態變化。初步研究結果發現，在治療前后血清中RNA的深度變化較大。2例病人用a一干擾素治療的病人中，雖然血清AI 轉為正常，但血清中的RNA含量變化不大。提示該方法對丙型肝炎的療效觀察有一定的參考價值。
    目前各醫療器械廠家出售的抗一HCV試劑盒，其間的試劑的靈敏度、特異性存在一定的差異 ，分別由重組基因多肽人工合成多肽組成，基因工程多肽的優點是：(1)可包含多個抗原位點。(2)一旦克隆表達成功則產量高、價格低。(3)表達多肽的穩定性好。(4)可將幾個片段重合使用，有較高的特異性和敏感性。(5)純化簡單，無其它蛋白干擾，可做抑制試驗。缺點是：(1)克隆表達技術要求較高，不易達到滿意結果。(2)表達產物純化困難，含有菌體等其它蛋白干擾。(3)每批產量間穩定性比間差異小。合成的EP27及其檢測結果，提示了它與第二代抗一HCV試劑的不同點 。