南京普朗醫療器械公司，檢驗技術交流篇之-----醫學真菌檢驗技術

醫學真菌學檢查是診斷真菌病的重要依據，隨著真菌感染病例的日益增多，對實驗室的診斷也提出了更高的要求。不論是患者淺部或深部感染診斷，幾乎全依賴于臨床標本的真菌學檢查。特別是系統性真菌感染，其早期特異的診斷方法是挽救患者生命的關鍵，而病原真菌的形態結構十分多樣，在不同條件下同一真菌也可有不同特點的形態。因此，在真菌的實驗室檢查中，必須熟練掌握各類真菌的形態特征以及在不同條件下的演變規律，才能獲得對致病真菌正確的診斷。目前真菌感染的實驗室檢查方法主要包括常規檢查法和特殊檢查法兩類。常規檢查法主要包括：①形態學檢查(直接鏡檢+染色鏡檢)。②培養檢查。③組織病理學檢查。特殊檢查主要包括：①血清學方法。②分子生物學方法。

        一、進行真菌實驗室診斷的注意事項

        ①應有獨立實驗室，不應與其他細菌、病毒等實驗室共用，以防發生相互污染。②在每天工作前與工作后，工作臺均要以消毒水例如5%石碳酸或0.5%過氧乙酸擦拭，如遇操作臺被真菌或標本污染，應即覆蓋紙巾，并用5%石碳酸消毒20min，切忌工作臺污染后即用水沖洗，以免污染擴散。③培養菌檢體及真菌污染的物質在丟棄前，必須高壓滅菌或焚燒。④在進行真菌檢查時，不可試著聞平板培養基特殊的氣味。⑤不可對Histoplasma capsulatum 以及 Coccidioides immitis進行載玻片培養技術，因為其等具有高度感染性的孢子能夠隨著空氣傳播。⑥實驗室禁止任意養花、草、動物等生物，以防實驗污染。⑦工作環境應定期消毒。一般紫外線照射不能殺滅真菌，應用40%甲醛(可于每4㎡空間用35ml 40%甲醛加18g高錳酸鉀在密閉情況下熏蒸24h，或用環氧乙烷進行消毒，每2～4周消毒1次。⑧如果用平板培養基接種標本，必須將平板培養基密封，以免發生危險，在不常做真菌檢測的實驗室，最安全的培養方法是利用含有棉花塞的試管培養基(使空氣能夠循環)。⑨美國梅育診所主張利用平板培養基進行真菌的分離，步驟如下:平板培養基必須在生物安全箱內操作及檢查。平板培養必須用膠帶封好，平板培養基必須含30ml的量，并保持培養箱60%以上的濕度，同時增加瓊脂的濃度至2%，以免脫水。⑩真菌的診斷，需要經驗的累積及備有良好的圖譜參考書。

        二、分離及鑒定真菌的培養基

        (一)配制培養基的一般原則

        ①各成分混勻后以文火緩慢加熱，并不斷攪拌，煮沸1min，過熱會破壞有效成分。②分裝試管應在高壓滅菌前，而分裝平皿應在高壓滅菌后。③高壓滅菌一般在118～121磅,10～15min。④需加血液或不能高壓的成分如抗生素，應在培養基冷卻至50 左右時加入混勻。⑤試管分裝量約7~8ml，平皿約15ml,如需培養4～6周，平皿內應有35～40ml的量。培養基中抗生素的濃度和添加方法：氯霉素、慶大霉素和放線菌酮能耐熱，可在培養基高壓滅菌前加入，其他抗生素均在培養基高壓滅菌后冷卻至45℃～50℃時加入。青霉素20～100μg/ml，鏈霉素40～200μg/ml，氯霉素50μg/ml，放線菌酮500μg/ml，慶大霉素5μg/ml。

        (二)分離和鑒定真菌的培養基

        各種醫學真菌所用培養基的成分，又可根據不同要求，分成分離、富集、選擇、特性研究等含不同成分培養基，具體見表。

表 分離鑒定真菌培養基分類表

        培養基種類 分離用培養基                        使用目的

        1.Brain heart infusion agar                                 分離腐生性及病原性真菌
        2.Brain heart infusion agar with antibiotics         分離除了皮膚絲狀真菌以外的真菌
        3.Brain heart infusion biphasic blood 
        Culture bottles                                                 從血液中分離真菌
        4.Dermatophyte test medium                              分離皮膚絲狀菌，建議僅做篩檢用
        5.Inhibitory mold agar                                        分離除了皮膚絲狀真菌以外的真菌
        6.Mycosel or mycobiotic agar                               分離皮膚絲狀菌
        7.Ssbouraud dextrose agar                                 分離腐生性及病原性真菌
        8.Yeast estract phosphate agar                         分離除了皮膚絲狀真菌以外的真菌

        區分試驗培養基

        1.Ascospore agar                                         檢測產子囊孢子酵母菌
        2.Cornmeal agar with Tween 80 and trypan blue         檢測產厚膜孢子酵母菌
        3.Cottonseed conversion agar                         使雙相型真菌由霉菌型轉變為酵母型
        4.Czapek’s agar                                         分離及區分Aspergillus spp
        5.Niger seed agar                                         鑒定Cryptococcus neoformans
        6.Nitrate reduction medium                         檢測Cryptococcus spp.還原nitrate能力
        7.Potato dextrose agar                                 證實Trichophyton rubrumm 產色素能力制作載玻片培養技術
        8.Yeast fermentation broth                           測定酵母菌的發酵能力
        9.Yeast nitrogen base agar                           測定酵母菌的糖類同化能力

        三、臨床樣本的采集與處理

        (一)皮屑 邊緣、皰壁、膿液、深層趾(指)間皮屑或活動邊緣皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH涂片，同時種于沙氏瓊脂加氯霉素2管，置25℃培養2周。

        (二)甲屑 用細挫或牙科磨鉆取病甲與正常甲交界處并且貼近甲床部的甲屑，標本用酒精浸泡待干燥后種于沙氏(SDA)培養4周，并同時作KOH涂片。

        (三)毛發 取病發(變色，無光澤，彎曲，脆易折斷，松動易拔除)15根，75%酒精消毒，3～5根作直接鏡檢，5～10根種于沙氏瓊脂(加氯霉素)，劃破斜面掩埋。

        (四)膿液 無菌采集，注意顆粒，用無菌蒸餾水稀釋后尋找?？勺鱃染色或抗酸染色，常規的KOH涂片及SDA接種培養也是必要的。

        (五)CSF 采集于無菌試管3～5ml，立即送檢。置冰箱不宜超過1h。離心后以無菌吸管吸取離心沉淀物1ml，作墨汁涂片鏡檢和培養(SDA)25℃或37℃4周。

        (六)血液 無菌抽血3～5ml立即于無菌抗凝管中，BHIB:血標本量為培養基量的1/10，37℃5～7d出現渾濁或菌團，挑取鏡檢同時移種SDA(注：每天檢查完畢后需搖動培養基，37℃震蕩培養可加速真菌的生長，提高檢出率。不作直接檢查，因其直接檢查陽性率低（血細胞分析儀）。

        (七)體液、痰液、尿液、糞便 ①體液標本量10ml離心沉淀取2ml沉淀液做直接鏡檢培養。②晨痰3～5ml集于無菌瓶中(無菌生理鹽水漱口數次后)，挑取黏液或膿性部分：KOH涂片培養。③早晨中段尿或清潔尿10ml，離心取沉淀液1ml做KOH涂片培養(SDA每管種0.5ml)。④拭子：一般盡量不用，缺點：A.不能得到足量的標本；B.采集的標本也不易從棉花纖維上分離下來;C.容易干竭。采集標本后應迅速放入內裝1~2ml無菌蒸餾水的試管送檢KOH涂片培養。⑤紙盒送檢，挑取黏液、膿血、乳酪樣部分KOH涂片培養(加抗生素)注：單純培養陽性，不一定有臨床意義，KOH涂片發現菌絲，有診斷意義。

        (八)組織：標本置無菌平皿中立即送檢，置無菌勻漿器加2ml蒸餾水，研磨成漿或1～2mm3的小塊，KOH涂片培養。

        四、真菌學檢驗的基本技術

        (一)直接鏡檢

        是最簡單也是最有用的實驗室診斷方法，常用的方法有：①氫氧化鉀/復方氫氧化鉀法：標本置于載玻片上，加一滴浮載液，蓋上蓋玻片，放置片刻或微加熱，即在火焰上快速通過2～3次，不應使其沸騰，以免結晶，然后輕壓蓋玻片，驅逐氣泡并將標本壓薄，用棉拭或吸水紙吸去周圍溢液，置于顯微鏡下檢查。檢查時應遮去強光，先在低倍鏡下檢查有無菌絲和孢子，然后用高倍鏡觀察孢子和菌絲的形態、特征、位置、大小和排列等。浮載液：A.10%~20%的KOH。配方：氫氧化鉀10～20g，蒸餾水加至100ml，待氫氧化鉀完全溶解后揺勻存放在塑料瓶內，適用于皮屑、甲屑、毛發、痂皮、痰、糞便、組織、耵聹等的檢查。B.復方氫氧化鉀溶液配方：氫氧化鉀(AR)10g，二甲基亞砜(AR)40ml,甘油50ml, 蒸餾水加至100ml,配制方法：將氫氧化鉀先加入30ml蒸餾水中溶解后，再依次加入DMSO、甘油揺勻后，用蒸餾水加到100ml，裝入塑料瓶內。此配方的優點是：配方中加DMSO，能促進角質的溶解，有甘油涂片不易干，不易制成氫氧化鉀結晶，氫氧化鉀的濃度相對低，腐蝕性亦低，為進行大面積普查或大批量采集標本作鏡檢帶來了方便。②膠紙粘貼法：用1cm×1.5cm的透明雙面膠帶貼于取材部位數分鐘后自取材部位揭下，撕去復帶在上面的底板紙貼在載玻片上，使原貼在取材部位的一面暴露在上面，再進行革蘭染色或過碘酸錫夫染色，在操作過程中應注意雙向膠帶粘貼在載玻片上時不可貼反，而且要充分展平，否則影響觀察。③涂片染色檢查法：在載玻片上滴1滴生理鹽水，將所采集的標本均勻涂在載玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再選擇適當的染色方法，染色后，以高倍鏡或油鏡觀察。

        常見鏡檢染色方法有：①革蘭染色。所有真菌、放線菌均為革蘭染色陽性，被染成藍黑色。適用于酵母菌、孢子絲菌、組織孢漿菌及諾卡菌、放線菌的感染。②乳酸酚棉藍染色：用于各種真菌培養物的鏡檢。③印度墨汁：用于檢測腦脊液(CSF)中的新生隱球菌。④抗酸染色：用于抗酸菌及諾卡菌的診斷。⑤瑞氏染色：用于組織胞漿菌和馬內菲青霉的檢測。⑥過碘酸錫夫染色(PAS)：用于體液滲出液和組織勻漿等。真菌胞壁中的多糖染色后呈紅色，細菌和中性細胞偶可呈假陽性，但與真菌結構不同，不難區別。⑦嗜銀染色(GMS)：真菌可染成黑色，主要用于測定組織內真菌。

        (二) 真菌培養

        從臨床標本中對致病真菌進行培養，目的是為了進一步提高對病原體檢出的陽性率，以彌補直接鏡檢的不足，同時確定致病菌的種類。真菌培養檢查除需要一般細菌檢驗用到的器具外，還應準備真菌專用的接種針、接種環、或接種鉤(用鉑絲或鎳絲制成)、微型小鏟、刀片、針頭等，常規分離鑒定使用的培養基為沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)斜面培養基，加0.05%氯霉素，還有多種性質的培養基(見第二部分)以滿足各種不同的需要，可酌情選用接種的方法，根據不同的臨床標本，大體可分為點植法和劃線法兩種。①點植法：適用于皮屑、甲屑、毛發、痂皮、組織等有形固體標本，將標本直接與培養基表面點狀接觸。②劃線法：適用于痰、分泌物、膿液、組織液、組織塊的研磨液等液體標本，用接種針(環)劃線接種在培養基表面。

        培養方法有多種，接臨床標本接種時間分為直接培養法和間接培養法；按培養方法分為試管法、平皿法(大培養)和玻片法(小培養)。①直接培養：采集標本后直接接種于培養基上。②間接培養：采集標本后，暫保存，以后集中接種。③試管培養：是臨床上最常用的培養方法之一，培養基置于試管中，主要用于臨床標本分離的初代培養和菌種保存。④大培養：將培養物接種在培養皿或特別的培養瓶內，主要用于純菌種的培養和研究。⑤小培養：主要用于菌種鑒定，大致分為三種：玻片法，方塊法和鋼圈法。A.玻片法：在消毒的載玻片上，均勻地澆上熔化的培養基，不宜太厚。凝固后接種待鑒定菌株，置于平皿中，保濕。待有生長后，蓋上消毒的蓋玻片，顯微鏡下直接觀察，常用米粉吐溫瓊脂培養基觀察白念珠菌的頂端厚壁孢子和假菌絲。B.方塊法：適用于霉菌菌落的培養。取無菌平皿倒入約15ml熔化的培養基，待凝固后用無菌小鏟或接種刀劃成1cm2大小的小塊。取一小塊移在無菌載玻片上，然后在小塊上方四邊的中點接種待鑒定菌株，蓋上消毒的蓋玻片，放入無菌平皿中的V形玻棒上，底部鋪上無菌濾紙，并加入少量無菌蒸餾水，孵育，待菌落生長后直接將載玻片置顯微鏡下觀察。C.鋼圈法：先將固體石蠟加熱熔化，取直徑約2cm，厚度約0.5cm有孔口的不銹鋼小鋼圈，火焰消毒后趁熱浸入石蠟油，旋即取出冷卻，石蠟油即附著于小鋼圈中。再取一無菌載玻片，火焰上稍加熱，將小鋼圈平置其上，孔口向上。小鋼圈上石蠟油遇載玻片的熱即熔化后凝固，鋼圈就會固定在載玻片上。用無菌注射器經孔口注入熔化的培養基，培養基量約占小鋼圈容量的1/2，注意避免氣泡。待培養基凝固后取一消毒蓋玻片，火焰上加熱后，趁熱蓋在小鋼圈表面，也即固定其上。最后用接種針伸入孔口進行接種。這種方法的優點是形成一種封閉式培養，在顯微鏡下直接觀察菌落時可避免孢子吸入人體，而且不易被污染，蓋玻片也可取下染色后封固制片保存。

        (三)培養檢查

        標本接種后，每周至少檢查2次，觀察以下指標：①菌落外觀：A.生長速度：緩慢生長菌：7～14d，快速生長菌：2～7d。一般淺部真菌超過2周深部真菌超過4周仍無生長，可報告陰性。B.外觀：a.扁平。b.疣狀。c.折疊規則或不規則。d.纏結或墊狀。e.其他。C.大小：菌落大小用cm來表示，菌落大小與生長速度和培養時間有關。D.質地：a.平滑狀。b.粉狀。c.粒狀。d.棉花狀。e.粗毛狀。f.皮革狀。g.粘液狀。h.膜狀。E.顔色：不同的菌種表現出不同的顔色，呈鮮艷或暗淡。致病性真菌的顔色多較淡，呈白色或淡黃色，而且其培養基也可變色，如馬爾尼菲青霉等，有些真菌菌落不但正面有顔色，其背面也有深淺不同的顔色。菌落的顔色與培養基的種類、培養溫度、培養時間、移種代數等因素有關。所以，菌落的顔色雖在菌種鑒定上有重要的參考價值，但除少數菌種外，一般不作為鑒定的重要依據。F.菌落的邊緣：有些菌落的邊緣整齊，有些不整齊。G.菌落的高度和下沉現象：有些菌落下沉現象明顯，如黃癬菌、絮狀表皮癬菌等，更有甚者菌落有時為之裂開。H.滲出物：一些真菌如青霉、曲霉的菌落表面會出現液滴。I.變異：有些真菌的菌落日久或多次傳代培養而發生變異，菌落顔色減退或消失，表面氣生菌絲增多，如絮狀表皮癬菌在2～3周后便發生變異。②顯微鏡檢查：小培養可置普通顯微鏡下直接觀察，而試管和平皿培養的菌落則需挑起后做涂片檢查。

        五、組織病理學檢查

        真菌病的組織病理檢查與直接鏡檢培養同樣具有相當重要的價值，尤其對深部真菌病的診斷意義更大，如用特殊染色可提高陽性率。

        真菌的組織病理反應與其他一些疾病的組織病理反應極其相似，往往只有在仔細研究了病理切片并發現了真菌之后才考慮到真菌病的診斷。而在這種情況下，標本已被固定，培養有時已不可能進行，組織病理切片就成了真菌感染的主要依據。所以臨床上在送病理標本的同時，要盡可能考慮到真菌感染的可能，以便同時采集標本送真菌實驗室進行真菌學檢查。

        真菌在組織內一般表現為：①孢子：酵母和雙相型真菌在組織內表現為孢子。②菌絲：許多真菌在組織中只表現為菌絲。組織中發現無色分隔、分支的菌絲多為念珠菌和曲霉。粗大、不分隔少分支的菌絲為接合菌，多為毛霉、根霉、犁頭霉等。粗大、少分支有隔的菌絲為蛙糞霉菌。棕色菌絲為暗色絲孢霉病，由暗色孢科真菌引起。③菌絲和孢子，主要見于念珠菌感染。④顆粒：為組織內由菌絲形成的團塊。⑤球囊或內孢囊：球囊內含有內孢子，為球孢子菌或鼻孢子菌在組織內的特征性結構。

        組織病理片中根據形態和染色能基本確定種名的真菌為：莢膜組織胞漿菌、杜波伊斯組織胞漿菌、副球孢子菌、皮炎芽生菌、鏈狀芽生菌、粗球孢子菌、新生隱球菌和鼻孢子菌等。根據組織病理中真菌的形態能確定屬而不能確定種的病為：放線菌病、奴卡菌病、無綠藻病、念珠菌病、曲霉病和不育大孢子菌病等。多個屬的真菌感染可引起相同的臨床表現，在組織病理中真菌的形態無法區別的病有皮膚著生芽生菌病、暗色絲孢霉病、接合菌病、皮膚癬菌病和足菌腫等。足菌腫的顆粒若染色適當，很易確定為放線菌性或真菌性的，也能區別出細菌性顆粒。真菌性顆粒中的菌絲又分為無色或暗色兩大類。各種病原菌基本上形成各自顔色、大小、形成和結構的顆粒，可以初步區別，但最后確定必須依靠真菌培養。

        六、血清學方法

        隨著診斷技術的進展，以免疫學方法檢測真菌病已成為可能，引起深部真菌感染的病原菌主要有白念珠菌、曲霉菌和隱球菌等，傳統的檢測方法主要為血培養和組織活檢，但血培養歷時太長，且深部真菌感染的病原菌常不易培養成功，陽性率較低。而深部真菌感染的臨床征象錯綜復雜，又使得組織活檢缺乏典型改變，影響正確診斷，這些都使得這些方法所起的作用極為有限，真菌的抗原、抗體及代謝產物的血清學檢查用于深部真菌感染的實驗室檢測，可取得很好的效果。目前常用的免疫診斷方法有：①特異性抗原的檢測：A.乳膠凝集試驗(LA)。B.酶聯免疫試驗(EIA)。C.熒光免疫測定法(FA)。②特異性抗體檢測：由于受檢者都為免疫低下患者，因其致陽性率低，故現已少用。（酶標儀）

        七、分子生物學方法

        近年來隨著分子生物學的發展，已有聚合酶鏈反應(PCR)擴增、分子探針、限制性酶切片段長度多態性分析(RFLP)、DNA指紋圖譜、隨機擴增DNA多態性(RAPD)等方法。用于深部真菌病的診斷和分型研究，形成了以PCR技術為基礎的一系列分子診斷方法。從這些新技術對多種致病真菌鑒定的應用過程中發現，此類方法具有操作簡便、省時省力、特異性、敏感性高的優點。特別是從分子水平對真菌從遺傳進化角度闡明菌種間內在的分類學關系，真正達到人們追求已久的自然分類的目的。我們有理由相信，隨著PCR及相關技術在臨床的應用及更廣泛深入的研究，將會對真菌感染的診斷和鑒定產生根本的影響。

文章來源---南京普朗醫療器械公司網編!